北京时间2022年12月16日，广东省智能科学与技术研究院（以下简称广东省智能院）王斌研究员实验室（脑认知神经网络发育和疾病研究组）与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心鲍岚研究员实验室以及复旦大学生物医学研究院杨力研究员实验室合作在国际学术期刊 EMBO Reports以Resource形式在线发表了题为“ Somatosensory neurons express specific sets of lincRNAs, and lincRNA CLAP promotes itch sensation in mice”的研究论文。该研究通过单细胞测序系统性地分析并构建了初级感觉神经元中细胞类型特异性的长链基因间非编码RNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）表达谱，同时揭示细胞类型特异表达lincRNA CLAP参与调控痒觉功能及其分子机制。
王斌研究员和鲍岚研究员团队长期对非编码RNA在神经元发育中的功能及其分子机制进行研究。课题组前期的研究工作发现，初级感觉神经元轴突中富集的microRNAs（miRNAs）通过调控轴突中的mRNA局部翻译参与轴突延伸（Wang et al., Cell Reports, 2015; Wang & Bao, Journal of Molecular Cell Biology, 2017）。课题组最近的研究发现，轴突富集的长链非编码RNA（lncRNA）ALAE通过竞争RNA结合蛋白 KHSRP与Gap43 mRNA的相互作用进而调节轴突局部翻译和轴突生长(Wei et al., Cell Reports, 2021)，lncRNA Dubr的m6A动态修饰通过稳定RNA结合蛋白YTHDF1/3介导mRNA翻译从而参与神经元迁移和轴突发育（Huang et al., Cell Reports, 2022），这些研究进一步揭示了神经元特异分布的非编码RNA在神经系统发育中发挥重要调控作用。
初级感觉神经元属于假单极神经元，它的胞体聚集形成背根神经节（Dorsal root ganglion，DRG）。DRG神经元能够把外周刺激通过脊髓进而传至大脑，传递疼痛、冷热、痒、机械和本体等多种感觉。在DRG神经元中存在高度特化的不同类型神经元，合作实验室张旭研究员团队前期的研究通过单细胞测序将DRG神经元分为10个大类和14个亚类，同时揭示不同类型神经元参与不同外周刺激的感觉传递（Li et a., Cell Research, 2016; Wang et al., Cell Research, 2021）。尽管对初级感觉神经元的分类和功能有所了解，但神经元类型特异的分子调控机制还远未研究清楚。
lincRNA是一类转录自编码基因间区域、缺乏蛋白翻译能力且长度超过200个核苷酸的非编码RNA。目前多组学测序数据分析提示，在神经系统中的lincRNA比mRNA具有更高的组织特异性，并可能发挥重要作用。因此，探究lincRNA在不同类型DRG神经元中的分布、功能及作用机制对解析不同外周刺激引起感觉传递的分子机制有重要意义。
本研究首先通过整合分析Smart-seq2和10x Genomics的初级感觉神经元单细胞测序数据，构建了单个神经元lincRNA的表达谱。通过计算特异性指数（Specificity measure, SPM）方法筛选并发现了200个细胞类型特异且高表达的lincRNA，并进一步通过单细胞PCR、原位杂交和流式分选等方法对不同细胞类型lincRNA进行了验证。同时，还发现细胞类型特异的lincRNA与其基因组上临近基因存在高度相关性，由于细胞核中定位的lincRNA能够参与调控临近基因的表达，提示细胞类型特异的lincRNA可能具有顺式调控作用。
单细胞测序鉴别初级感觉神经元细胞类型特异lincRNAs
随后通过对细胞类型特异性lincRNA的进化保守性分析，发现在生长抑素（Sst+）表达的神经元中lncRNA 9130409J20Rik 特异性高表达，并且在多物种中保守性最高。利用基因共表达分析，提示lncRNA 9130409J20Rik与痒觉功能高度相关，因此我们将其命名为CLAP （Cell-type-specific LincRNA Associated with Pruritus）。进一步采用神经元钙成像、小鼠鞘内注射siRNA和AAV病毒携带shRNA后的痒觉行为学检测以及RNA-seq等实验，发现敲低CLAP显著抑制组胺对Sst+神经元的激活、降低小鼠对组胺诱导的痒觉抓挠反应以及导致Sst+神经元中与痒觉相关基因的显著下调。最后，通过对高通量免疫共沉淀测序数据库（CLIP-seq）分析、RNA免疫共沉淀和小鼠鞘内注射siRNA等实验，发现RNA结合蛋白MSI2与CLAP相互结合并参与调控CLAP对痒觉相关基因的表达。
通过单细胞测序构建初级感觉神经元细胞类型特异lincRNA表达谱并发现
lincRNA CLAP调控痒觉的功能和分子机制
综上所述，本研究通过单细胞测序建立了初级感觉神经元类型特异分布的lincRNA表达谱，揭示了细胞类型特异性表达的lincRNA在痒觉传递中发挥调控功能及其分子作用机制。该研究不仅有助于深入理解神经元不同类型特异分布的lincRNA在不同躯体感觉信息传递中的作用和机制，而且为疼痛和慢性瘙痒等感觉相关疾病的发生机制和临床诊疗提供了理论基础。
广东省智能院王斌研究员、中科院分子细胞卓越中心鲍岚研究组博士研究生姜博文和中科院上海营养与健康研究所杨力团队博士研究生李国卫为本文共同第一作者。鲍岚研究员、杨力研究员和王斌研究员为共同通讯作者。这项工作得到了中科院上海高等研究院/广东省智能科学与技术研究院的张旭研究员、广东省智能科学与技术研究院的李昌林研究员、复旦大学脑科学研究院的韩清见研究员和浙江大学医学院的徐贞仲研究员的大力支持。该工作得到了国家基金委、广东省高水平创新研究院项目和中国医学科学院项目的资助。
文章链接：https://www.embopress.org/doi/abs/10.15252/embr.202154313
